1、收集細胞。上皮細胞需要蛋白酶消化，然后收集。加PBS或者流式洗液1ml，振蕩，1400rpm離心5min，棄上清。

 

2、染表型懸浮細胞于100ul體積，細胞濃度約為或者小于1X10^6，加入流式染色抗體。按照說明書用量或者減半（根據(jù)經(jīng)驗），分出一管作為同型。

 

3、4℃，避光30min，用PBS洗一遍，1400rpm離心5min，棄上清。

 

4、破膜破膜劑以BDpharmingen破膜劑為例，加300ul，4℃，避光30min以現(xiàn)配的破膜洗液1ml洗一遍。1400rpm離心5min，棄上清。

 

5、胞內(nèi)染色加入流式抗體4℃，避光30min。用破膜洗液1ml洗一遍，1400rpm離心5min，棄上清。

 

6、加入200ul1～2％多聚甲醛4℃避光保存。一般情況下，可直接把抗體加入到棄上清后的殘留液里（體積大概為50ul左右）。

 

二、 BD C6流式細胞儀標本制備注意事項：

 

1、整個操作在4℃下進行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaNO3，上述實驗條件是防止一抗結合細胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落；

 

2、洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結合，出現(xiàn)假陰性；

 

3、加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色；

 

4、細胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。